Sebenarnya serotyping untuk
Streptococcus pneumoniae itu cukup mudah, namun reaksi PCR yang harus dijalankan memang cukup banyak. Menurut Carvalho (2010) pada jurnal "
Revisiting Pneumococcal carriage by Use of Broth Enrichment and PCR Techniques for Enhanced Detecion of Carriage and Serotyping" bahwa penggunaan broth encirhment (5 ml Todd-Hewitt yeast extract dan 1 ml rabbit serum), serotyping dengan conventional multiplex PCR, dan lytA real-time PCR menjadi metode yang paling efektif untuk deteksi pneumokokus. Broth enrichment yang diikuti dengan PCR approch dapat meningkatkan deteksi multi-serotype dan low-density pneumococcal carriage.
Serotyping
S. pneumoniae dengan conventional multiplex PCR (cmPCR) terdiri dari 7 reaksi untuk multi serotype dan 1 reaksi untuk serogrup 6. Disebut dengan multiplex karena menggunakan beberapa primer pada setiap reaksinya. Terdiri dari 5 primer untuk ketujuh reaksi dan 2 primer pada reaksi untuk serogrup 6. Serotyping dengan metode ini mampu mendeteksi hingga 70 serotype, namun ada beberapa serotype yang butuh tahap identifikasi lanjutan dengan Quellung atau Latex Agglutination. Contohnya seperti serotype 15B/15C atau serogrup 6A/6B/6C/6D. Meskipun Quellung Test mampu mendeteksi hingga 90 serotype, namun jika seluruh isolat dikerjakan dengan metode ini, maka biaya yang dikeluarkan akan jauh lebih besar mengingat harga Quellung kit yang tidak murah. Selain itu, Quellung test juga membutuhkan waktu yang lebih lama karena harus dicobakan ke beberapa pool serum dan diamati di bawah mikroskop.
Panel cmPCR yang digunakan juga tergantung dari wilayah mana isolat tersebut berasal. Ada panel untuk isolat Amerika, Afrika atau Latin Amerika. Panel ini disesuaikan dengan serotype yang lebih sering ditemukan pada studi sebelumnya. Misal serotype 14, 6, 23F, 19A dan 9V/9A menjadi serotype pada reaksi 1 untuk panel Latin Amerika dikarenakan pada sebelumnya, kelima serotype tersbeut menjadi serotype yang paling sering ditemukan pada isolat Latin Amerika. Hal ini tentu dapat menghemat sumber daya yang digunakan karena sudah dapat mengidentifikasi banyak serotype pada reaksi pertama.
Selain itu, perlu diingat bahwa hasil positif pada cmPCR memberikan band DNA yang tebal (it will be strongly positive), dikarenakan ekstraksi DNA (dapat menggunakan metode fast extraction dengan enzim hyaluronidase&mutanolysin) dilakukan dari isolat murni. Jika band DNA yang muncul tipis, sebaiknya reaksi PCR diulang. Apabila setelah reaksi PCR band DNA yang masih tipis, maka sebaiknya ekstraksi DNA diulang. Jika masih terjadi, mungkin band DNA tipis tersebut adalah unspecific band dan kemudian dapat dikonfirmasi dengan Quellung test. Berbeda dengan DNA dari clinical sample seperti CSF yang belum tentu memiliki banyak copy DNA, maka band DNA yan muncul mungkin saja tidak terlalu tebal (ekstraksi DNA clinical sample sebaiknya menggunakan Qiagen kit sehingga DNA yang didapatkan dapat lebih banyak dan lebih murni).
Jika isolat tidak mampu teridentifikasi serotype-nya menggunakan cmPCR, maka hal pertama yang perlu diperhatikan adalah gen cpsA-nya. Jika pada reaksi 1 gen cpsA sudah negatif maka harus segera ditumbuhkan lagi untuk kemudian dilakukan bile test, sehingga tidak banyak biaya dan waktu yang terbuang. Jika hasil bile positif maka dapat dilanjukan hingga reaksi terakhir (mengingat serotype 38 tidak memiliki gen cpsA). Sedangkan jika hasil bile negatif maka isolat tersebut tidak dapat diikutsertakan pada tahapan identifikasi selanjutnya karena berarti isolat tersebut adalah pneumo-negative. Perlu diingat bahwa
S. mitis/oralis/infantis dapat sensitif terhadap optochin, sehingga uji bile menjadi penting untuk membedakannya dengan
S. pneumoniae.
Apabila isolat negatif untuk keseluruhan reaksi cmPCR, maka dilanjutkan dengan Quellung Test. Jika masih negatif dengan Quellung Test, maka isolat tersebut dikategorikan sebagai NT (non typeable)
Streptococcus pneumoniae.
Gambar 1. Reaksi 1 Pada Panel Latin Amerika
Gambar 2. Isolat Positif Untuk Serotype 14 Pada Reaksi 1
