Suspect colony Streptococcus pneumoniae
(Dokumentasi pribadi)
Haemophilus influenzae
(Dokumentasi pribadi)
1. Sample Collection
Pertama tentang sample collection. Kalau selama ini sih gue ngerjain sample carriage, berupa nasopharyngeal swab (NP Swab). Sebenarnya sampelnya bisa macem-macem, bisa dari darah atau cerebrospinal fluid (CSF) juga. Pada pasien sepsis/bakterimia biasanya sampel yang diambil berupa darah, sedangkan untuk pasien meningitis diambil dari CSF.
Sample collection ini penting banget, teman-teman. Sangat penting untuk diperhatikan, karena kalau pengambilannya ga bagus, bakterinya juga akan keambil. Misal nih kalau dari NP Swab, kita harus memastikan kalau cotton swab-nya memang sudah mencapai nasofaring. Kalau cotton swab masuknya masih kurang dalam dan tidak mencapai nasofaring, akibatnya bakteri yang banyak tumbuh justru akan Staphylococcus, sedangkan S. pneumoniae dan H. influenzae yang memang flora alami nasofaring tidak ikut terambil. Bisa juga terambil, tapi jumlahnya mungkin mudah 'rentan' dan 'kalah' jika digabungkan dengan bakteri lain, tentunya kalau sudah di luar tubuh ya. Cara untuk memastikan agar swab masuk ke dalam nasofaring adalah dengan mengukur jarak dari hidung ke telinga, lalu bisa ditandai dengan spidol di swab-nya. Jarak tersebut lah yang menandai panjang swab yang harus masuk. Meskipun menimbulkan kondisi yang tidak nyaman, namun jika pengambilannya dilakukan secara benar, maka pengambilan sampelnya hanya beberapa detik saja. Indikator keberhasilannya adalah orang yang diswab akan 'menangis'. Jahat ya bikin orang nangis.
Nasopharyngeal swab
(https://i.ytimg.com/vi/DVJNWefmHjE/hqdefault.jpg)
Setelah swab selesai dilakukan maka cotton-swab dipotong dengan gunting steril (dibersihkan dengan alkohol swab terlebih dahulu). Panjang cotton swab yang dipotong lebih kurang sekitar 2 cm, sehingga dapat masuk ke dalam media STGG (Skim milk, Tryptone, Glucose and Glycerol) yang telah disiapkan dalam cryotube. Media STGG adalah media penyimpanan bakteri yang paling baik selain darah. Media ini lebih nutritious dibandingkan BHI (Brain Heart Infusion) yang selama ini biasa digunakan. Gue inget perkataan trainer gue dari US: "When you store the bacteria in STGG media, keep them in -80. It will be forever. They will live forever. You will die first". Sampe segitunya ya hehe
Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan media STGG adalah jangan disterilkan pada suhu yang terlalu tinggi, karena protein dari skim milk dan glucose nya akan rusak. Warnanya akan coklat. Salah satu ciri media STGG yang baik adalah warnanya kuning pucat. Jadi cukup diautoclave pada suhu 115C selama 10 menit.
Untuk media STGG yang akan digunakan selama satu minggu, maka cukuplah hanya disimpan di suhu kulkas 4C, sedangkan untuk penggunaan yang agak lama (misal kita ingin collecting sampelnya satu bulan ke depan), maka bisa disimpan di -80. Penyimpanan media STGG yang akan digunakan di suhu 4C akan sangat memudahkan kita, karena jika akan digunakan dan disimpan pada suhu -80, butuh waktu yang lama untuk membuatnya thawing. Bakteri juga bisa mati kalau ada temperature shock. Bayangkan saja mereka lagi asyik di nasofaring dengan suhu tuuh kita yang 37C, kemudian tiba-tiba dimasukan ke STGG yang masih dingin dengan suhu 2C misalnya. Kalau di suhu 4C mudah untuk membuatnya tidak dingin dan siap untuk digunakan.
2. Media Preparation
Ini juga penting banget! kenapa? ingat, yang akan kita dapatkan adalah fastidious bacteria. Mereka ga bisa tumbuh kalau medianya ga cukup kaya. Apalagi untuk H. influenzae, coklat agar yang dibuat harus sempurna. Oke disini gue akan bagi jadi dua bagian, bagian pneumokokus dan Hi.
Untuk pneumokokus mereka ditumbuhkan di media blood agar (BA). Sebenarnya membuat BA cukup mudah, hanya saja ada beberapa tips agar pneumo yang tumbuh gemuk-gemuk dan subur hehe
Jika media BAnya tidak cukup kaya, pneumo yang tumbuh akan menjadi sangat kecil dan terlihat kering. Kalau hal ini terjadi, tentu akan sangat mengganggu tahap identifikasi. Morfologi khas pneumo berupa 'flat-deprressed center' atau cekung di bagian tengah dengan tekstur koloni yang smooth, tentu tidak akan bisa terlihat. Selain itu, jika ternyata ada dua serotipe (pembagian jenis penumokokus berdasarkan struktur kapsul polisakarida yang dimilikinya) pneumokokus dari satu sampel, tentu tidak akan jelas dibedakan jika medianya kurang baik. Mereka akan sama-sama kecil dan kering, hal ini akan menyebabkan data yang diperoleh akan bias.
Tips bertama untuk membuat BA adalah, homogenkan darah dengan sempurna sebelum menuangnya ke agar broth. Kenapa ini penting? karena kalau kurang homogen, medianya akan berwarna orange. Artinya si media hanya kebagian plasmanya aja. Jadi kalo bisa darahnya ditaruh di botol duran terus di putar-putar perlahan hingga darahnya homogen. Toh yang pneumo suka sel darahnya, bukan plasmanya. Dan perlu diperhatikan, jangan menggunakan darah manusia, karena didalamnya lebih banyak antibodi yang menghambat pertumbuhan bakteri. Kalo gue biasa pakai darah domba, kalau domba ga ada darah kuda bisa. Tips kedua untuk BA adalah jangan menuang darah ke agar broth yang terlalu panas. Kenapa? karena nutrisi di darahnya akan rusak. Warna darahnya juga akan menghitam. Untuk memastikan kalau kita menuangnya tidak terlalu panas adalah dengan meletakan erlenmeyer agar broth ke nadi yang di lipatan tangan (namanya apa sih), karena kalau hanya dipergelangan tangan sensor panasnya kurang peka. Kaya kamu ga peka, iya kamu. Oke fokus. Kita lanjut. Jadi setelah kita rasa cukup hangat, maka darah bisa dituang. Untuk BA bisa pakai columbia agar, Tryptone Soya Agar (TSA) dari Oxoid, atau Trypticase Soy Agar dari BD. Untuk TSA dari BD mereka punya TSA II juga, atau dikenal sebagai TSA modification. TSA II ini punya tambahan growth factor. Kalo gue lebih recommend yang TSA II ini, karena pneumokokus yang tumbuh jadi lebih besar, aktivitas alfa haemolytic-nya juga lebih jelas. Bagus banget buat membedakan kalau memang ada double serotype. Ohiya untuk persentase darah gue biasa pakai 8%, sebenarnya sih 5% juga sudah cukup baik. Tapi mereka ga akan protes kan aklau nutrisi yang tersedia lebih banyak. Seperti kita, kalau memang makanan yang diberikan lebih banyak, ga akan protes kan? hehe Intinya sih bakteri bahagia, kitapun bahagia lah!
Blood Agar (Kanan; TSA II 8% darah, Kiri;TSA II 5% darah)
(Dokuemntasi pribadi)
Sedangkan untuk coklat agar sebagai media pertumbuhan H. influenzae yang perlu diingat adalah bahwa bakteri ini perlu faktor X dan V untuk bisa tumbuh. Maksud faktor X disini adalah hemin, sedangkan faktor V adalah nicotinamide adenine dinucleotida (NAD). Untuk menyediakan hemin gue biasanya menggunakan darah yang dipanaskan, ini ternyata lebih bagus dibandingkan pakai hemoglobin bentuk powder. Gimana cara membuatnya? Jadi setelah media diautoclave dengan suhu 121°C selama 10 menit, segeralah diletakan di water bath dengan suhu 70°C. Oia gue lupa bilang, gue biasanya pakai GC agar dengn 8% sheep blood. Naah setelah suhu media sudah stabil di 70°C, maka darah dapat dimasukan, setelah itu dihomogenkan dan dipanaskan lagi di suhu 70°C. Kemudian didiamkan sekitar 20 menitan. Indikator media siap dituang adalah warnanya yan berubah menjadi coklat susu, seperti susu milo hangat (jadi mau hehe). Jika warna medianya masih warna coklat tua, berarti masih toksik, dijamin Hi ga akan mau numbuh. Manja ya? Memaang!
3. Lab Analysis
Identifikasi bakteri apapun dimulai dengan teknik streaking yang baik, sehingga dilusinya dapat berjalan. Ketika dilusinya berjalan, maka single colony bisa didapatkan. Untuk identifikasi pneumokokus bisa dilihat dari koloninya yang memiliki morfologi flat-depressed center, terlihat shiny, smooth, dan memiliki aktivitas alfa hemolitik (dilihat dari zona kehijauan disekitar koloni). Sedangkan Streptococcus lain biasanya lebih kecil dan struktukrnya lebih kering. Setelah didapatkan koloni yang suspect pneumokokus, tahap selanjutnya adalah dites dengan optochin disk (ethylhydrocupreine hydrochloride). Oia jika ditemukan morfologi koloni suspect pneumokokus yang berbeda, maka seluruhnya hars dipick untuk tes optochin ya. Misal kita menemukan koloni yang lebih besar dan lebih kecil, keduanya tentuk tetap memiliki karakter pneumokokus ya. Kalau yang tumbuh white colony tanpa aktivitas alfa hemolitik, ya tidak usah dipick ya hehe.
Setelah koloni dipick dan dites dengan optochin disc, kemudian plate diinkubasi pada suhu 37°C dengan 5% CO2. Positive result dapat dilihat dari zona jernih yang muncul setelah 18-24 jam inkubasi. Jika tidak ada zona jernih yang terbentuk, sedangkan koloni yang tumbuh memiliki karakter seperti pneumokokus, maka dapat dilakukan bile solubility test. Pneumokokus akan larut sempurna di dalam sodium deoxycholate.
Streptococcus pneumoniae
(Dokumentasi pribadi)
Sedangkan H. influezae mimiliki karakter opaque, creamy dan memiliki bau yang khas. Jika sudah ada suspect colony maka dapat dilakukan uji identifikasi lainnya, seperti X and V factor. Hi hanya akan tumbuh di XV disk. Jika sampel yang kita uji hanya tumbuh di faktor X atau V saja, maka dapat dipastikan bukan H. influenzae. Setelah itu dapat dilakukan uji oksidase, Hi akan menunjukan hasil positif pada uji oksidase. Selanjutnya dpaat dilakukan gram staining, Hi adalah bakteri gram negatif. Jika hasil kulturnya bagus, sehingga Hi bahagia, kita dapat melihat bentuk pleomorfik bakteri ini.
Alur Identifikasi H. influenzae
(https://www.cdc.gov/meningitis/lab-manual/images/chapt9-figure03-view.gif)
very good information for me as an microbiology analyst at Airlangga University Hospital. Keep share your good knowledges and experiences. Regards.
BalasHapus